გენეტიკური კვლევების ჩატარების პროცესში ხშირად ვხვდებით არასაკმარის რნმ-ს ნიმუშებს, მაგალითად, პირის ღრუს მცირე ანატომიური სიმსივნეების შესასწავლად, თუნდაც ერთუჯრედიანი ნიმუშები და სპეციფიკური გენის მუტაციების ნიმუშები, რომლებიც ტრანსკრიბირებულია ძალიან დაბალ დონეზე ადამიანის უჯრედებში.რა თქმა უნდა, COVID-19 ტესტისთვის, თუ ტამპონი არ არის საჭირო ადგილას ან არ არის საკმარისი დრო სინჯის აღებისას, ნიმუშის ზომა იქნება ძალიან დაბალი, რის გამოც ჯანმრთელობისა და ოჯახის დაგეგმვის კომისია გამოვიდა ორი დღის წინ და ჩააბარა ტესტი და თუ ნუკლეინის მჟავას სინჯის შემქმნელმა არ აიღო ექვსი ნიმუში, შეგიძლიათ შეატყობინოთ.
რეაგენტის მგრძნობელობა მნიშვნელოვანია, რადგან ჩვენ გვაქვს ესა თუ ის პრობლემა, რა შეგვიძლია გავაკეთოთ RT-PCR-ის მგრძნობელობის გასაუმჯობესებლად?
სანამ შესაძლო გადაწყვეტილებებს განვიხილავთ, მოდით აღვნიშნოთ ორი დიდი გართულება იმ სიტუაციიდან, რომელიც ახლახან აღვნიშნეთ.
უპირველეს ყოვლისა, ჩვენ ვღელავთ რნმ-ის დაკარგვაზე, როდესაც ჩვენს ნიმუშში გვაქვს მხოლოდ რამდენიმე უჯრედის პოპულაცია.თუ გამოყენებული იქნება გამოყოფის და გაწმენდის ტრადიციული მეთოდები, როგორიცაა სვეტის მეთოდი ან ნუკლეინის მჟავა ნალექის მეთოდი, დიდია ალბათობა იმისა, რომ რამდენიმე ნიმუში დაიკარგოს.ერთი გამოსავალი არის გადამზიდავი მოლეკულის დამატება, როგორიცაა tRNA, მაგრამ მაშინაც კი, არ არსებობს გარანტია, რომ ჩვენი აღდგენის ექსპერიმენტი წესრიგშია.
მაშ რა არის უკეთესი გზა?კულტივირებული უჯრედების ან მიკროანატომიური ნიმუშების კარგი ვარიანტია პირდაპირი ლიზის გამოყენება.
იდეა არის უჯრედების გაყოფა 5 წუთის განმავლობაში, რნმ-ის გათავისუფლება ხსნარში, შემდეგ შეჩერება რეაქცია 2 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ლიზატი პირდაპირ საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციაში, ისე რომ რნმ არ დაიკარგოს და ბოლოს მიღებული cDNA პირდაპირ ჩადოთ. რეალურ დროში რეაქციაში.
მაგრამ რა მოხდება, თუ შეზღუდული საწყისი წერტილის ან სამიზნე გენის მცირე რაოდენობის გამო, ჩვენ შეგვიძლია გადავამუშაოთ მთელი რნმ და მაინც არ მივაწოდოთ საკმარისი შაბლონები რეალურ დროში კარგი სიგნალის მისაღებად?
ამ შემთხვევაში, წინასწარი გაძლიერების ნაბიჯი შეიძლება ძალიან სასარგებლო იყოს.
ქვემოთ მოცემულია სქემა საპირისპირო ტრანსკრიფციის შემდეგ მგრძნობელობის გაზრდის მიზნით.დაწყებამდე, ჩვენ უნდა ვიკითხოთ ქვემოთ, რომელი სამიზნეები გვაინტერესებს, რათა შევიმუშავოთ კონკრეტული პრაიმერები ამ სამიზნეებისთვის წინასწარი გაძლიერებისთვის.
ამის მიღწევა შესაძლებელია შერეული პრაიმერის შექმნით 100-მდე წყვილი პრაიმერით და რეაქციის ციკლით 10-დან 14-ჯერ.ამიტომ, ამ მოთხოვნისთვის სპეციალურად შექმნილი Master Mix საჭიროა მიღებული cDNA-ს წინასწარი გაძლიერებისთვის.
ციკლების რაოდენობის 10-დან 14-მდე დაყენების მიზეზი არის ის, რომ ციკლების ეს შეზღუდული რაოდენობა უზრუნველყოფს შემთხვევითობას სხვადასხვა სამიზნეებს შორის, რაც გადამწყვეტია მკვლევრებისთვის, რომლებსაც სჭირდებათ რაოდენობრივი მოლეკულური ინფორმაცია.
წინასწარი გაძლიერების შემდეგ, ჩვენ შეგვიძლია მივიღოთ დიდი რაოდენობით cDNA, ასე რომ აღმოჩენის მგრძნობელობა უკანა ბოლოში მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდება და ჩვენ შეგვიძლია განზავდეს ნიმუშიც კი და ჩავატაროთ მრავალი რეალურ დროში PCR რეაქცია შესაძლო შემთხვევითი შეცდომების აღმოსაფხვრელად.
გამოქვეყნების დრო: აპრ-11-2023